🧪 Peptide Titration 計算機

所謂滴定胜肽，就是持續加入強酸或強鹼，直到分子上每一個可滴定基團都反應完畢。本計算器求的正是這條滴定曲線的當量點：你可以算出「已知濃度的滴定劑需要滴入幾毫升」，也可以反過來算「在固定滴入體積下，滴定劑要配到多濃才會剛好到達當量點」。公式適用於任何胜肽或蛋白質溶液，屬於純化學計量換算，不涉及任何國家或地區的特定法規。

當量點完全由化學計量決定：滴定劑的莫耳數等於可滴定基團的莫耳數。設 C_p 為胜肽濃度（mM）、V_s 為樣品體積（mL）、n 為每個胜肽分子的可滴定基團數（當量數）、C_t 為滴定劑濃度（mM）：

由於毫莫耳濃度乘以毫升會得到微莫耳，單位可以完全消去，因此 V_t 直接以 mL 為單位。把同一條等式改解濃度，就得到 C_t = ((C_p × V_s × n) ÷ (V_t))。n 請直接從序列數出來：游離的 α-胺基端與 α-羧基端，再加上在你掃描的 pH 區間內滴定劑真正碰得到的可解離側鏈（天門冬胺酸 Asp、麩胺酸 Glu、組胺酸 His、離胺酸 Lys、精胺酸 Arg、半胱胺酸 Cys、酪胺酸 Tyr）。

取 10 mL 濃度 2 mM 的胜肽溶液，該胜肽帶有 3 個可滴定基團，以 50 mM 的 NaOH 滴定。胜肽的物質量為 2 × 10 = 20 \mumol，因此需要中和的當量數是 20 × 3 = 60 \mumol：

到達當量點時的總體積為 11.2 mL，胜肽被稀釋到約 1.79 mM。

等當量點計算使用五個量。保持其單位正確（毫摩爾和毫升，相乘得微摩爾）是使算術變得平凡的原因。

當量點與終點。當量點是化學計量理想：添加的滴定液摩爾數恰好等於可滴定位點的摩爾數，C_t V_t = C_p V_s n。終點是您實際觀察到的——指示劑的顏色變化或pH電極跡線中的拐點。兩者的差異是滴定誤差；使用匹配良好的指示劑或基於導數的拐點搜尋時，差異通常很小，但計算器返回當量點，而不是預測的終點讀數。

可滴定（可電離）基團。肽上任何在掃描的pH窗口內得到或失去質子的化學基團：α-氨基末端、α-羧基末端和天冬氨酸、穀氨酸、組氨酸、半胱氨酸、酪氨酸、賴氨酸和精氨酸的側鏈。酰基阻斷末端（乙酰基或-NH₂保護的肽）不可滴定，不能計算。

當量。一莫爾質子轉移（在酸鹼工作中）。每莫爾含三個可滴定質子的肽提供三當量，這正是因子n編碼的內容。

當量濃度與摩爾濃度。摩爾濃度計算每升溶質的莫爾數；當量濃度計算每升的當量數。對於一價滴定液（如NaOH或HCl），兩者在數值上相同。對於多價滴定液則不同：0.1 M H₂SO₄是0.2 N，0.1 M Ba(OH)₂是0.2 N。該計算器以摩爾濃度工作，因此如果滴定液標記為當量濃度，請先轉換——C_t(mM) = 1000 × N / z，其中z是每個滴定液分子可交換質子的個數。

等電點（pI）。肽淨電荷為零的pH值。在滴定曲線中，它是圍繞中性物種的pKa值之間的pH中點，是一個有用的交叉檢查：富含天冬氨酸/穀氨酸的肽應顯示低pI，並消耗比酸多得多的鹼。

緩衝區和拐點。在每個pKa附近，隨著滴定液的添加pH變化緩慢——緩衝區，以半當量點為中心，其中pH = pKa。在緩衝區之間，曲線變陡；最陡的點（dpH/dV的最大值，二階導數的零點）是實驗中用於定位當量點的拐點。pKa值相差約2個單位以內的肽會給出合併的、解析度差的拐點。

標準化滴定液。一種滴定液，其濃度已對照初級標準物質（對於鹼為鄰苯二甲酸氫鉀，對於酸為三羥甲基氨基甲烷或碳酸鈉）驗證，而不是相信標籤上的數值。NaOH會吸收大氣CO₂並發生漂移，所以未標準化的C_t是系統性V_t錯誤的最常見來源。

當量因子n不是您為整個肽查閱的性質——您通過計算在您掃描的pH窗口內實際改變質子化狀態的可電離基團來構建它。該表列出了標準參考pKa值，這些是為遊離胺基酸測量的值，也是大多數生化課本引用的值。

重要警告。這些是遊離胺基酸參考值。在肽內，相同基團通常因相鄰骨架、電荷-電荷相互作用、氫鍵和在結構化肽中的掩埋而移位約±1個pH單位——有時更多。末端基團移位最多：肽中的α-羧基通常更接近3.1–3.6，α-氨基更接近7.7–8.5。將該表視為n的計數輔助工具，而不是精確滴定曲線位置的來源。

計算示例。以三肽H-天冬氨酸-丙氨酸-賴氨酸-OH（DAK）為例，兩個末端遊離，用標準化NaOH從pH 2滴定到pH 11：

1. C-端賴氨酸的α-羧基——計算，+1
2. 天冬氨酸側鏈——計算，+1
3. N-端天冬氨酸的α-氨基——計算，+1
4. 賴氨酸ε-氨基（pKa ≈ 10.5）——在pH 11時僅部分滴定；僅當您掃描超過pH ≈ 12時才計算它（+1），否則忽略
5. 丙氨酸——無可電離側鏈，不貢獻

所以在pH 2 → 11滴定時n = 3，在掃描超過pH 12時n = 4。如果相同序列提供乙酰化和C-末端酰胺化（乙酰基-DAK-NH₂），兩個末端會被阻斷，在pH 2 → 11窗口中n會下降到1（僅天冬氨酸）。在選擇n前，始終在供應商的分析證書上確認末端化學。

整個計算是一個化學計量平衡——滴定液的摩爾數等於可滴定質子的摩爾數：

1. 將肽量轉換為mM。如果從稱量固體開始，使用
   C_p(mM) = (( mass (mg)) ÷ (MW (g/mol) × V_s(mL))) × 1000
   使用肽的淨肽含量（已知時）——凍乾肽帶有反離子（三氟乙酸、乙酸鹽）和殘留水分，所以稱量質量通常高估真實肽10–30%。
2. 計算肽量的微摩爾數。n_{pep} = C_p × V_s。因為1 mM × 1 mL = 1 µmol，無需單位轉換。
3. 從序列和pH窗口確定n。計算遊離末端加上pKa值落在您實際掃描範圍內的可電離側鏈（見上面的pKa表）。排除被阻斷的末端、二硫鍵結合的半胱氨酸，以及在正常水性掃描中的精氨酸。
4. 計算所需滴定液微摩爾數。n_{eq} = C_p × V_s × n。
5. 求解未知數。除以滴定液濃度得到體積，V_t = n_{eq}/C_t；或除以固定可遞送體積得到您必須準備的濃度，C_t = n_{eq}/V_t。
6. 檢查單位。mM × mL = µmol，µmol ÷ mM = mL。如果您的答案差1000倍，您幾乎肯定混淆了M與mM或L與mL。
7. 計算當量點時的體積和稀釋。V_{total} = V_s + V_t，稀釋肽濃度為C_{final} = C_p V_s / V_{total}。稀釋因子V_{total}/V_s在您計劃對滴定溶液進行分光讀數時很重要。
8. 合理性檢查V_t是否實用。目標是使用滴定管的良好部分的滴定液體積——大約其標稱容量的20–80%，或自動微滴定器上至少幾百微升。如果V_t出來低於約0.1 mL，稀釋滴定液；如果超過滴定管體積或稀釋樣品超過約兩倍，濃縮滴定液或減少V_s。

計算示例

您將12.0 mg分子量為1200 g/mol的肽溶解在5.00 mL水中，並用標準化50 mM NaOH進行滴定。肽有遊離C-端、遊離N-端和一個穀氨酸殘基，您掃描pH 2 → 11，所以n = 3。

1. 肽量：12.0 ÷ 1200 = 0.0100 mmol = 10.0 µmol。
2. 濃度：C_p = 10.0\ \mumol ÷ 5.00\ mL = 2.00 mM。
3. 所需當量：n_{eq} = 2.00 × 5.00 × 3 = 30.0 µmol的OH⁻。
4. 滴定液體積：
   V_t = ((2.00\ mM × 5.00\ mL × 3) ÷ (50\ mM)) = ((30.0\ \mumol) ÷ (50\ mM)) = 0.600\ mL

在添加0.600 mL 50 mM NaOH後達到當量點。當量點處的總體積是5.00 + 0.600 = 5.60 mL，稀釋肽濃度為C_{final} = 10.0 ÷ 5.60 = 1.786 mM——稀釋因子為1.12。注意0.6 mL在50 mL滴定管上是小讀數；使用1 mL或2.5 mL微滴定管，或給出V_t = 3.00 mL的10 mM滴定液會更精確地遞送。

下方每一行都遵循V_t = C_p V_s n / C_t，其中V_{total} = V_s + V_t和C_{final} = C_p V_s / V_{total}。第1–3行是同一肽樣品在不同pH窗口上滴定（不同的n），這是實際操作中混淆的最大來源。

表格閱讀

• n線性縮放V_t。第1–3行僅在當量計數上不同，V_t從0.400移動到2.000 mL。在三肽上誤計一個可電離基團是預測當量體積的33%誤差，遠大於任何現實的滴定管誤差。
• 將滴定液強度與樣品負荷匹配。稀釋行（25 mL中0.2 mM）含有僅10 µmol的可滴定質子，需要10 mM滴定液以提供可讀的1.000 mL；濃縮行攜帶400 µmol，需要100 mM以保持在5 mL以下。一個有用的經驗法則是選擇C_t ≈ C_p × n × V_s / V_{target}，其中V_{target}設定為舒適的滴定管讀數。
• 最後一行是失敗模式，不是食譜。1 M滴定液對10 µmol質子需要10 µL——低於大多數手動滴定管的解析度，單個偏差滴（~50 µL）會使當量點超過五倍。將該滴定液稀釋100倍至10 mM會將V_t移至1.000 mL並恢復可用精度。
• 注意稀釋。n = 5行在達到當量點時將肽從2 mM稀釋到1.667 mM（因子1.20）。如果您計劃測量吸光度、螢光或對滴定溶液的後續測定，請對V_{total}/V_s進行校正，而不是假設起始濃度。